細胞凍存是又是最復雜的生物學實驗，簡單是因為初入門的生物學小白也懂得如何凍存細胞；而復雜是因為，一個細胞凍存方案，是個國際性難題——如何優化冷凍保護劑(Cryoprotectant CPA),如何科學優化凍存曲線，保證一個好的復蘇活率，這是個仰之彌高，鉆之彌堅的問題。

低溫生物學領域最著名的，莫過于Mazur雙因素假說——水冰相變

根據Mazur兩因素假說，細胞在凍存過程中，如果降溫太慢，就會發生不可逆的損傷性脫水，例如線粒體和內質網在結構上受損。如果冷卻太快，細胞沒有足夠的時間來達到最佳脫水狀態，剩余的細胞內水會形成冰，這也是有害的，會損害細胞器的結構。

Applications and optimization of cryopreservation technologies to cellular therapeutics

Mazur雙因素假說符合多年來實際觀察到的結果。這就是經常被引用的“-1℃/min冷卻速率”的起源 “-1℃”并不是一個神秘的數字，而是反映了在低溫保存過程中，細胞達到最佳脫水狀態所需的時間。這是在冷卻細胞時生物質本身的安全冷卻動力學，而不僅僅是冷凍設備的控制參數。

沖擊冷卻，誘導冰核產生

當液體冷卻時，只有當溫度降至溶液的平衡冰點以下時才能發生成核，在冰成核過程中，液體分子相互碰撞、聚集并形成團簇。這是一個隨機發生的過程。通過在低溫冷卻器中快速冷卻約2分鐘，引入簡短的“沖擊冷卻”步驟，也可以誘導冰核產生。冰成核是相變的一部分，冰晶的形成是一種放熱相變，向環境釋放熱量，使樣品瞬間升溫。此時需要引入一個保持時間（大約10分鐘，取決于樣本），以允許冷卻控制的潛熱消散。

Walking on thin ice: controlled freezing & thawing of pharmaceutical active molecules

凍存保護劑的影響

Kymriah和Yescarta (FDA批準的前兩種CART細胞藥物)分別使用7.5%和5%的DMSO進行低溫保存，在冷凍保存溶液中添加類似的糖和/或大分子。二甲基亞砜(DMSO)，被認為是“金標準”冷凍保護劑(CPA)，用于冷凍保存幾乎所有有治療意義的細胞(紅細胞除外)。DMSO在長期暴露和輸注期間具有高度的細胞毒性，可在高達50%的患者中引起輕微不良反應，以及更罕見但更嚴重的心血管、神經或呼吸問題。

一些CPA(如二甲基亞砜或甘油)會穿過細胞膜并提供細胞內保護，而其他一些制劑，如糖或聚合物，雖然細胞內滲透很少，依然可以在細胞系統中提供CPA效應，這歸因于它們產生部分脫水和限制細胞內有害冰晶的形成。

這是一個“經驗法則”，幾乎所有有核的哺乳動物細胞在冷凍保存期間都需要細胞內保護;非滲透性CPA可以為調節細胞外環境中的冰晶生長(從而有助于減輕冰形成的滲透效應)。大分子聚合物，不進入細胞，直接保護細胞膜，誘導在細胞外形成玻璃化的溶液。

Applications and optimization of cryopreservation technologies to cellular therapeutics

不同的包材類型對程序性降溫過程的顯著影響

Development of a Reliable, Low-cost, Controlled Cooling Rate Instrument for the Cryopreservation of Hematopoietic Stem Cells

一套穩定成熟的程序降溫方式，可以有效維持細胞活性，滿足細胞高質量凍存需求，保證細胞凍存環節的安全性，合規性。一臺安全可靠的程序性降溫儀，是至關重要的一個環節。它可以提供沖擊冷卻，控制冰核生成，保證一度每分鐘的降溫速率，均一化標準化地冷凍大批量的樣本。

程序性降溫主要是通過微處理器控制系統和電磁閥，通過控制噴入腔體中的液氮量來精確控制降溫速率。其優點是：控溫精確，受外界環境影響小。尤其是處理大體積樣本時，快速噴入的大量液氮更易帶走樣本中的潛熱，從而快速降溫，保證更好的樣本復蘇活性。

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